Tento názov podľa rovnomennej knihy Vladimíra Mináča som zvolil naschvál. Myslím si, že doba sa s dobou míňa, a ľudská pamäť je krátka. Vyhasína ako pahreba. Situácie, ktoré sme zažili od roku 2020 postupne blednú, strácajú svoju hroznú tvár. Je to pochopiteľné. To, čo je nepochopiteľné je to, že zloduchovia, ktorí toto všetko spôsobili, ostávajú nepotrestaní. Chodia medzi nami, niektorí sa nám škeria do tváre, iní zmizli z „masmédií“, či obrazoviek, kamsi zaliezli. Je ticho. To ticho kričí, ale akoby len tak, do vetra. Podstatné je to, že ak zloduchov, ktorí nám to predpeklie na Slovensku spôsobili, nepotrestáme, tak „nám to urobia“ znovu. A budú nebezpečnejší, rafinovanejší, krutejší. Ako sa hovorí, s jedlom rastie chuť. Dôsledky podávania mRNA (DNA) preparátov sa postupne prejavujú, ale oficiálna moc sa tvári, že neexistujú. „Zodpovední“ sú na kľúčových postoch, pričom drhnú, dusia, bagatelizujú. Alebo sa oportunisticky vtierajú a "vysvetľujú". Dokedy ešte? A načo vlastne čakajú? Na stratu pamäte, či na zázrak „zvonku“?
Práca „RT-PCR Test Targeting the Conserved 5'-UTR of SARS-CoV-2 Overcomes Shortcomings of the First WHO-Recommended RT-PCR Test“ (Ulrike Kämmerer, Sona Pekova, Rainer J. Klement, Rogier Louwen, Pieter Borger, Klaus Steger. International Journal of Vaccine Theory, Practice, and Research. 3(1) April 4, 2023 https://doi.org/10.56098/ijvtpr.v3i1.71) bola publikovaná v roku 2023. Je tak „plná“ dát, že ju budeme rozoberať postupne, na niekoľko „dielov“. Citácie z textu vynecháme.
In contrast to the WHO-recommended Charité protocol - recommending 45 cycles without defining a Ct for positive versus negative discrimination, but resulting in a high rate of false-positives at Ct >35, the proposed 5'-UTR assay clearly outperformed the Charité protocol in terms of specificity (no non-specific PCR products, even when applying 45 cycles), while retaining the necessary sensitivity. In contrast to downstream genes, which are prone to mutations, the 5'-UTR genomic sequence is crucial for regulating viral protein synthesis by the human host and inherently remains stable in coronaviruses, as it also does in SARS-CoV-2. Therefore, we were able to use the 5'-UTR assay successfully throughout the putative COVID-19 pandemic irrespective of the downstream genomic heterogeneity of the individual circulating strains observed over time (i.e., alpha, beta, gamma, delta, and, also, omicron). The 5'-UTR assay is distinguished by no false background (i.e., a negative sample really is PCR negative). In total, 31,028 samples have been tested with 2,737 of them being positive (8.8%).
Based on our years of experience in the field of quantitative molecular microbiology, we adopted the following routine criterion to evaluate the clinical significance of the measured SARS-CoV-2 viral load: Ct<25, highly positive (>10e6 copies/ml); Ct 25-30, positive; Ct 30-35, positive traces, but unlikely to be infectious; Ct >35, negative, not infectious (<10e2 copies/ml). Note that “copy numbers” might differ between laboratories, as there is a difference between copy numbers present in a PCR reaction tube and in an authentic patient sample. In the latter, various dilution steps have to be considered: RNA contained in 1 ml swab is transferred into 50 μl elution buffer, from which 4 μl is used for the cDNA synthesis, from which 2 μl is used for the PCR reaction. We re-calibrated by recalculating the initial sample volume in order to make all our PCR results comparable to standard classical cell culture measurements. We rated Ct 25 to equate our standard at Ct 20 reprezentant the patient’s sample cut-off for a plausible correlation with the infectious viral load.
Na rozdiel od protokolu Charité odporúčaného WHO, ktorý odporúča 45 cyklov bez definovania Ct pre rozlíšenie pozitívnych a negatívnych výsledkov, ale vedie k vysokej miere falošne pozitívnych výsledkov pri Ct >35, navrhovaný test 5'-UTR jasne prekonal protokol Charité z hľadiska špecificity (žiadne nešpecifické produkty PCR, ani pri použití 45 cyklov), pričom si zachoval potrebnú citlivosť. Na rozdiel od downstream génov, ktoré sú náchylné na mutácie, genomická sekvencia 5'-UTR je kľúčová pre reguláciu syntézy vírusových proteínov ľudským hostiteľom a vo vírusoch koronavírusu zostáva stabilná, rovnako ako v prípade SARS-CoV-2. Preto sme mohli úspešne používať test 5'-UTR počas celej predpokladanej pandémie COVID-19 bez ohľadu na downstreamovú genómovú heterogenitu jednotlivých cirkulujúcich kmeňov pozorovaných v priebehu času (tj. alfa, beta, gama, delta a tiež omikron). Test 5'-UTR sa vyznačuje tým, že nemá falošné pozadie (tj. negatívna vzorka je skutočne PCR negatívna). Celkovo bolo testovaných 31 028 vzoriek, z ktorých 2 737 bolo pozitívnych (8,8 %).
Na základe našich dlhoročných skúseností v oblasti kvantitatívnej molekulárnej mikrobiológie sme prijali nasledujúce rutinné kritérium na hodnotenie klinického významu nameranej vírusovej záťaže SARS-CoV-2: Ct<25, vysoko pozitívny (>10e6 kópií/ml); Ct 25-30, pozitívny; Ct 30-35, pozitívne stopy, ale pravdepodobne nie infekčné; Ct >35, negatívny, neinfekčný (<10e2 kópií/ml). Upozorňujeme, že „počet kópií“ sa môže líšiť v závislosti od laboratória, pretože existuje rozdiel medzi počtom kópií prítomných v skúmavke PCR reakcie a v autentickej vzorke pacienta. V druhom prípade je potrebné zohľadniť rôzne kroky riedenia: RNA obsiahnutá v 1 ml výteru sa prenesie do 50 μl elučného pufru, z ktorého sa 4 μl použije na syntézu cDNA, z ktorej sa 2 μl použije na PCR reakciu. Prekalibrovali sme prepočítaním počiatočného objemu vzorky, aby boli všetky naše výsledky PCR porovnateľné so štandardnými klasickými meraniami bunkovej kultúry. Ohodnotili sme Ct 25, aby sme zrovnali náš štandard pri Ct 20 reprezentujúci hranicu vzorky pacienta pre pravdepodobnú koreláciu s infekčnou vírusovou záťažou.
A teraz to, ako celý čas drístali a tárali (a na Slovensku im rozdrapene sekundovali):
CT-VALUE CORRELATES WITH TARGET GENE AMOUNT
The cycle threshold (Ct), also called cycle quantification (Cq), is the cycle number when the fluorescence of the amplified PCR product can be specifically detected above the background signal. It represents a measure of the amount of a specific nucleic acid sequence that was present in the original sample. The lower the Ct value, the more target material was initially present.
As reverse transcription, priming conditions, and secondary structures at the primer binding sites represent stochastic processes, the Ct-value may vary between different RT-PCR runs and different laboratories. Therefore, reference genes of defined amounts must be included to measure relative quantification between various study groups. This represents a minimum requirement for a “robust diagnostic tool”, but inexplicably was not performed by the authors of the Charité protocol. In addition, absolute quantification of a defined viral load present in a specific sample requires qPCR methodology with a dilution series of known amounts of inactivated virus. Subsequently, the Ct-value of an unknown sample can be correlated with the Ct-values of the dilution series and the virus number can be estimated to determine the viral copiesper ml — the so-called “viral load”.
For SARS-CoV-2, it was reported as early as April 2020 (co-authored by first and senior authors of the Charité protocol) that a minimum of 106 RNA copies/ml are comparable with a viral load that can be used to infect a proper cell culture and thus is defined as “potentially infectious”. Performing 45 PCR cycles, the Charité protocol was described to detect as little as four RNA copies per sample (approximately 1000 RNA copies/ml). Some commercial test kits report a detection threshold of 10 RNA copies per sample. This is roughly between 1000 and 10000-fold more sensitive than the infectious viral load required to cultivate SARS-CoV-2 in a proper cell culture setting. Incomprehensibly, the Charité protocol counts any sample with a PCR signal up to 45 cycles explicitly positive without defining any Ct cut-off value that discriminates between a positive/negative decision, and without any correlation to control samples comprising defined RNA copy numbers.
In a systematic review published in December 2020, it was suggested that samples with Ct>25 will not contain enough genetic material to correlate with an infectious potential. In June 2021, autori correlated 3,790 positive RT-PCR samples with subsequent successful cell cultures. Those authors demonstrated that the virus can be cultivated in 70%, 20% and 3% of the samples when applying Ct-values of 25, 30 and 35, respectively. In August 2021, other authors, reported that Ct-values between symptomatic and asymptomatic subjects typically differ by more than four cycles (25.5 versus 29.6, respectively). They concluded that the Ct-value for defining potentially infectious individuals should be lowered from 30 to 25.
Hodnota CT koreluje s množstvom cieľového génu
Cyklová prahová hodnota (Ct), nazývaná aj cyklová kvantifikácia (Cq), je počet cyklov, pri ktorom je možné špecificky detegovať fluorescenciu amplifikovaného produktu PCR nad úrovňou pozadia. Predstavuje mieru množstva špecifickej sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá bola prítomná v pôvodnej vzorke. Čím nižšia je hodnota Ct, tým viac cieľového materiálu bolo pôvodne prítomného.
Keďže reverzná transkripcia, podmienky primingu a sekundárne štruktúry v miestach viazania primérov predstavujú náhodné procesy, hodnota Ct sa môže líšiť medzi rôznymi behmi RT-PCR a rôznymi laboratóriami. Preto je potrebné zahrnúť referenčné gény s definovanými množstvami, aby bolo možné merať relatívnu kvantifikáciu medzi rôznymi študijnými skupinami. To predstavuje minimálnu požiadavku na „robustný diagnostický nástroj“, ale autori protokolu Charité to z nepochopiteľných dôvodov nevykonali. Okrem toho absolútna kvantifikácia definovanej vírusovej záťaže prítomnej v konkrétnej vzorke vyžaduje metodiku qPCR s radom riedení známych množstiev inaktivovaného vírusu. Následne je možné korelovať hodnotu Ct neznámej vzorky s hodnotami Ct radu riedení a odhadnúť počet vírusov na určenie počtu vírusových kópií na ml – takzvanú „vírusovú záťaž“.
V prípade SARS-CoV-2 bolo už v apríli 2020 (v spoločnom autorstve prvého a hlavného z autorov protokolu Charité) uvedené, že minimálne milión kópií RNA/ml je porovnateľné s vírusovou záťažou, ktorá môže infikovať správnu bunkovú kultúru, a preto je definované ako „potenciálne infekčné“. Pri vykonaní 45 cyklov PCR bol protokol Charité opísaný tak, že dokáže detegovať až štyri kópie RNA na vzorku (približne 1000 kópií RNA/ml). Niektoré komerčné testovacie súpravy uvádzajú detekčnú hranicu 10 kópií RNA na vzorku. To je približne 1000- až 10 000-násobne citlivejšie ako infekčná vírusová záťaž potrebná na kultiváciu SARS-CoV-2 v riadnom prostredí bunkovej kultúry. Nepochopiteľne, protokol Charité považuje akúkoľvek vzorku s PCR signálom až do 45 cyklov za výslovne pozitívnu bez definovania akejkoľvek Ct hraničnej hodnoty, ktorá rozlišuje medzi pozitívnym/negatívnym výsledkom, a bez akejkoľvek korelácie s kontrolnými vzorkami obsahujúcimi definované počty kópií RNA.
V systematickom prehľade uverejnenom v decembri 2020 bolo naznačené, že vzorky s Ct>25 nebudú obsahovať dostatok genetického materiálu na to, aby korelovali s infekčným potenciálom. V júni 2021 autori korelovali 3 790 pozitívnych vzoriek RT-PCR s následnými úspešne infikovanými bunkovými kultúrami. Títo autori preukázali, že vírus je možné kultivovať v 70 %, 20 % a 3 % vzoriek pri použití hodnôt Ct 25, 30 a 35. V auguste 2021 iní autori uviedli, že hodnoty Ct medzi symptomatickými a asymptomatickými subjektmi sa zvyčajne líšia o viac ako štyri cykly (25,5 oproti 29,6). Dospeli k záveru, že hodnota Ct na definovanie potenciálne infekčných jedincov by sa mala znížiť z 30 na 25.
P.S. Vzhľadom na to, že som vlastnými rukami urobil stovky vzoriek RT-PCR (iných ako stanovenie SARS-CoV-2) dodávam nasledovné:
1. Pri počte 45 cyklov často „svieti“ (je pozitívna) aj čistá voda, ktorá sa používa ako jedna z kontrol pri stanoveniach.
2. Vzorky je potrebné robiť ako triplikáty (niektoré časopisy pre publikáciu žiadajú quadruplikáty). Títo robili „monoplikáty“. MUDr. Soňa Peková, PhD., vo svojom súdnoznaleckom posudku (https://www.10letters.org/CzechResearch.pdf ) robila pentaplikáty.
3. Byť „pozitívny“ na RT-PCR dokonca aj za „normálnych podmienok“, ktoré neboli dodržané, stále neznamená byť chorý. Ide o medicínu postavenú na hlavu. Pretože, "RT-PCR CAN ONLY SUPPORT, BUT NOT REPLACE MEDICAL DIFFERENTIAL DIAGNOSES" ("RT-PCR MÔŽE LEN PODPORIŤ, ALE NEMÔŽE NAHRADIŤ MEDICÍNSKE DIFERENCIÁLNE DIAGNÓZY"). Však, vy medicínski niktoši a primitívi?
4. Stále je reč o RT-PCR. Ten antigénový testovací shit si mohli strčiť rovno do vlastných análnych otvorov. Aspoň by spáchali menej zla. Ale dukáty nesmrdeli, však?
P.P.S. . Nepochopiteľne, protokol Charité považuje akúkoľvek vzorku s PCR signálom až do 45 cyklov za výslovne pozitívnu bez definovania akejkoľvek Ct hraničnej hodnoty, ktorá rozlišuje medzi pozitívnym/negatívnym výsledkom, a bez akejkoľvek korelácie s kontrolnými vzorkami obsahujúcimi definované počty kópií RNA.
Nepochopiteľne je jemné vyjadrenie pre tých podvodníkov a podliakov páchajúcich obludné zločiny. Stačí jediná otázka: Kam zmizla na dva roky chrípka? „Vyparila“ sa?
Publikované: 02.08.2025
.