DNA Purification vs Direct Measurement of Vaccine DNA (Čistenie DNA vs. priame meranie DNA vo vakcíne)
A message to Achs et al.
These are your colleagues you mocked (in your preprint and we appreciate your new tone) over a topic you still haven’t mastered.
If you did master it, you would have run your ONT system on these vaccines as both McKernan, Speicher, and Buckhaults all benchmarked on those systems 1st and you chose to run an Illumina (ILMN) system (ironically titrating the vax DNA with a Qubit) to distort the fragmentomics.
This was very deliberate and it is obvious to everyone in the genomics field that you did this. ILMN is no representation of the fragment lengths. It will never amplify a 5.3Kb fragment we found with ONT and you’ll never convince anyone in the field that your two SPRI preps, 10 cycles of Library PCR and subsequent cluster PCR is a real representation of the fragment size. Your own Agilent ILMN library data proves this.
Lets all back off the accusations and try to sharpen each others methods. We think your preps are still under measuring this with fluorometry. Your qPCR assays are all different size amplicons and not aligned with observations seen in 4 other studies by researcher less conflicted than you.
You partially address this. McKernan, Speicher, Buckhaults and Fleming all saw 4-6 CT offsets between Spike and plasmid backbones reinforcing Moderna’s concerns that qPCR can only get us within 2 order of magnitude of the answer. Both BioNtech (Lenk et al) and Sutton et al have published that DNaseI has a 100 fold handicap in hydrolyzing RNA:DNA hybrids while the regulators are being snowed that a single qPCR amplicon (where these hybrid species don’t exist) can address this problem! Your own qPCR data displays so much variability that when your money was on the table for titrating your Illumina runs, you went with Fluorometry! Actions speak louder than ideology and vitriol.
And while the above disclosed DNA prep biases may bump you slightly over the 10ng limit, they still don’t match other peoples observations using RNase that are 5-15 fold over. This could be different vials? It could be bias which may exist on each side of this debate?
What was interestingly missing from your discussion section was why you think this 10ng limit is still valid given it was derived with naked DNA? No one in the field transfects with Naked DNA and expects the same results as Lipofectamine.
You never addressed Moderna’s concerns over the residual DNA being oncogenic?
You never addressed Moderna’s warning about qPCRs failure to properly measure this?
You never addressed Georgiou et al demonstrating PicoGreen under measuring DNaseI treated DNA by 70%.
While its great you had 3 different associated labs verify your results, they are all working from the same vials and share the same conflicts using the same methods. This may reinforce your own echo-chamber but it will not convert people on the fence.
Fire up those ONTs. We published methods that address these small fragments in their process. You likely need to add more Ampure to capture the small DNA as ONT is tailored to large fragment capture. Apply the same prep philosophy you had with qPCR (Direct injection, no manipulation with parlor trick standards) to fluorometry. Use RNaseA as we have suggested but more importantly, after you RNaseA it, Treat it with DNaseI-XT and report how many nanograms disappear with a DNA specific enzyme. We’ve seen 240ng disappear with this approach. EMAs own data shows vial to vial can vary 200 fold. So hold off on the ad hom attacks until your N numbers justify it and your conflicts are properly declared.
Posolstvo pre Achs a spol.
Toto sú vaši kolegovia, ktorých ste vysmievali (vo vašej predbežnej tlači, oceňujeme však váš nový tón) kvôli téme, ktorú stále neovládate.
Ak by ste ju ovládali, spustili by ste svoj systém ONT na týchto vakcínach, pretože McKernan, Speicher aj Buckhaults najprv testovali tieto systémy a vy ste sa rozhodli spustiť systém Illumina (ILMN) (ironicky titrujúc vakcínovú DNA pomocou Qubit), aby ste skreslili fragmentomiku.
Bolo to veľmi úmyselné a pre každého v oblasti genomiky je zrejmé, že ste to urobili. ILMN nezobrazuje dĺžky fragmentov. Nikdy nezosilní fragment 5,3 Kb, ktorý sme našli s ONT, a nikdy nepresvedčíte nikoho v tejto oblasti, že vaše dve prípravy SPRI, 10 cyklov knižničnej PCR a následná klastrová PCR sú skutočným zobrazením veľkosti fragmentov. Vaše vlastné údaje z knižnice Agilent ILMN to dokazujú.
Všetci sa vzdajme obvinení a skúsme zdokonaliť svoje metódy. Myslíme si, že vaše prípravy stále podhodnocujú výsledky merania fluorometriou. Vaše qPCR testy sú všetky rôznej veľkosti amplikónov a nezodpovedajú pozorovaniam zo 4 iných štúdií, ktoré vykonali výskumníci menej konfliktní ako vy.
Čiastočne sa tým zaoberáte. McKernan, Speicher, Buckhaults a Fleming (Kotlár, Peková) všetci zaznamenali 4-6 CT posuny medzi Spike a plazmidovými kostrami, čo posilňuje obavy spoločnosti Moderna, že qPCR nám môže poskytnúť odpoveď len s presnosťou na 2 rády. BioNtech (Lenk et al) aj Sutton et al uverejnili, že DNaseI má 100-násobný handicap pri hydrolýze hybridov RNA:DNA, zatiaľ čo regulátori sú presvedčení, že jediný qPCR amplikón (kde tieto hybridné druhy neexistujú) môže tento problém vyriešiť! Vaše vlastné údaje qPCR vykazujú takú veľkú variabilitu, že keď ste mali na stole peniaze na titráciu vašich Illumina behov, rozhodli ste sa pre fluorometriu! Činy hovoria viac ako ideológia a jedovaté slová.
A hoci vyššie uvedené skreslenia pri príprave DNA môžu mierne prekročiť limit 10 ng, stále nezodpovedajú pozorovaniam iných ľudí, ktorí používajú RNázu, použijúc RNázu, ktorá je 5-15-násobne vyššia. Mohlo by to byť spôsobené rôznymi injekčnými liekovkami? Mohlo by to byť skreslenie, ktoré môže existovať na oboch stranách tejto diskusie?
Zaujímavé je, že vo vašej diskusnej časti chýbalo vysvetlenie, prečo si myslíte, že tento limit 10 ng je stále platný, keďže bol odvodený z holej (nezabalenej) DNA? Nikto v tejto oblasti neuskutočňuje transfekciu holou DNA a neočakáva rovnaké výsledky ako pri Lipofectamine.
Nikdy ste sa nezaoberali obavami spoločnosti Moderna, že reziduálna DNA je onkogénna?
Nikdy ste sa nezaoberali varovaním spoločnosti Moderna, že qPCR nedokáže správne merať túto hodnotu?
Nikdy ste sa nezaoberali Georgiou et al, ktorí preukázali, že PicoGreen podhodnocuje meranie DNA ošetrenej DNaseI o 70 %.
Hoci je skvelé, že ste mali 3 rôzne pridružené laboratóriá, ktoré overili vaše výsledky, všetky pracujú s rovnakými injekčnými liekovkami a zdieľajú rovnaké konflikty pri použití rovnakých metód. To môže posilniť vaše vlastné ego, ale nepresvedčí to ľudí, ktorí sú na vážkach.
Spustite ONT. Zverejnili sme metódy, ktoré riešia tieto malé fragmenty v ich procese. Pravdepodobne budete musieť pridať viac Ampure, aby ste zachytili malé DNA, pretože ONT je prispôsobené na zachytávanie veľkých fragmentov. Na fluorometriu použite rovnakú filozofiu prípravy, akú ste mali pri qPCR (priama injekcia, žiadna manipulácia so štandardmi salónnych trikov). Použite RNaseA, ako sme navrhli, ale čo je dôležitejšie, po použití RNaseA to ošetrite DNaseI-XT a nahláste, koľko nanogramov zmizne s enzýmom špecifickým pre DNA. Pri tomto prístupe sme zaznamenali zmiznutie 240 ng. Vlastné údaje EMA ukazujú, že medzi jednotlivými fľaštičkami môžu byť 200-násobné rozdiely. Takže s osobnými útokmi počkajte, kým to vaše čísla N odôvodnia a vaše konflikty budú riadne deklarované.
P.S. A ja dodávam: Prestaňte už konečne tárať nezmysly o bezpečnosti vakcín typu „...ale pre bežnú populáciu môžem jednoznačne povedať, že vakcíny sú bezpečné...“, pretože sú medicínsky, odborne a spoločensky nebezpečné.
P.P.S.
