Quantification of residual plasmid DNA and SV40 promoter-enhancer sequences in Pfizer/BioNTech and Moderna modRNA COVID-19 vaccines from Ontario, Canada
David J. Speicher , Jessica Rose and Kevin McKernan
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08916934.2025.2551517
Abstract
For some of the COVID-19 vaccines, the drug substances released to market were manufactured differently than those used in clinical trials. Manufacturing nucleoside-modified mRNA (modRNA) for commercial COVID-19 vaccines relies on RNA polymerase transcription of a plasmid DNA template. Previous studies identified high levels of plasmid DNA in vials of modRNA vaccines, suggesting that the removal of residual DNA template is problematic. therefore, we quantified the DNA load in a limited number of Pfizer-BioNTech and Moderna COVID-19 modRNA vaccine vials using two independent methods. total DNA and specific DNA targets were quantified by Qubit fluorometry and quantitative polymerase chain reaction (qPCR), respectively on32 vials representing 16 unique vaccine lots. RNase a treatment was used to assess the impact of RNA crosstalk in DNA fluorometry. A preliminary assessment of DNA fragment length and DNase I sensitivity were also performed. total DNA ranged 371–1,548 ng/dose and 1,130–6,280 ng/dose in Pfizer and Moderna products, respectively. Specific DNA of multiple plasmid DNA targets ranged 0.22–7.28 ng/dose for Pfizer, and 0.01–0.78 ng/dose for Moderna. the SV40 promoter-enhancer-ori (0.25–23.72 ng/dose) was only detected in Pfizer vials. Oxford Nanopore sequencing of one vial found mean and maximum DNA fragment lengths of 214 bp and 3.5 kb, respectively. These data demonstrate the presence of 1.23 × 10 8 to 1.60 × 10 11 plasmid DNA fragments per dose encapsulated in lipid nanoparticles. Using fluorometry, total DNA in all vials tested exceeded the regulatory limit for residual DNA set by the US Food & Drug administration (FDA) and the World Health authorization (WHO) by 36–153-fold for Pfizer and112–627-fold for Moderna after accounting for nonspecific binding to modRNA. When tested by qPCR, all Moderna vials were within the regulatory limit, but 2/6 Pfizer lots (3vials) exceeded the regulatory limit for the SV40 promoter-enhancer-ori by 2-fold. The presence of the SV40 promoter-enhancer element in Pfizer vials raises significant safety concerns. This study emphasizes the importance of methodological considerations when quantifying residual plasmid DNA in modRNA products, considering increased LNP transfection efficiency, and cumulative dosing presents significant and unquantified risks to human health.
Abstrakt
Niektoré vakcíny proti COVID-19, ktoré boli uvedené na trh, boli vyrobené iným spôsobom ako vakcíny použité v klinických štúdiách. Výroba nukleozidom modifikovanej mRNA (modRNA) pre komerčné vakcíny proti COVID-19 sa opiera o transkripciu RNA polymerázy z plazmidovej DNA šablóny. Predchádzajúce štúdie identifikovali vysoké hladiny plazmidovej DNA v injekčných liekovkách s vakcínami modRNA, čo naznačuje, že odstránenie zvyškov DNA šablóny je problematické. Preto sme kvantifikovali obsah DNA v obmedzenom počte injekčných liekoviek s vakcínami Pfizer-BioNTech a Moderna COVID-19 modRNA pomocou dvoch nezávislých metód. Celkový obsah DNA a špecifické ciele DNA boli kvantifikované pomocou Qubit fluorometrie a kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (qPCR) v 32 injekčných liekovkách reprezentujúcich 16 jedinečných šarží vakcín. Na posúdenie vplyvu RNA crosstalk v DNA fluorometrii bola použitá RNáza a liečba. Bolo tiež vykonané predbežné posúdenie dĺžky fragmentov DNA a citlivosti DNázy I. Celková DNA sa pohybovala v rozmedzí 371–1 548 ng/dávka a 1 130–6 280 ng/dávka v produktoch Pfizer a Moderna. Špecifická DNA viacerých plazmidových DNA cieľov sa pohybovala v rozmedzí 0,22 – 7,28 ng/dávka pre Pfizer a 0,01 – 0,78 ng/dávka pre Moderna. Promotor-enhancer-ori SV40 (0,25 – 23,72 ng/dávka) bol detegovaný iba v injekčných liekovkách Pfizer. Sekvenovanie jednej injekčnej liekovky pomocou Oxford Nanopore zistilo priemernú a maximálnu dĺžku fragmentov DNA 214 bp, resp. 3,5 kb. Tieto údaje dokazujú prítomnosť 1,23 × 10 exp8 až 1,60 × 10 exp11 fragmentov plazmidovej DNA na dávku zapuzdrenú v lipidových nanočasticiach. Pri použití fluorometrie celkové množstvo DNA vo všetkých testovaných injekčných liekovkách prekročilo regulačný limit pre reziduálnu DNA stanovený americkým Úradom pre kontrolu potravín a liečiv (FDA) a Svetovou zdravotníckou organizáciou (WHO) 36- až 153-násobne v prípade spoločnosti Pfizer a 112- až 627-násobne v prípade spoločnosti Moderna po zohľadnení nešpecifického viazania na modRNA. Pri testovaní pomocou qPCR boli všetky injekčné liekovky Moderna v rámci regulačného limitu, ale 2/6 šarží Pfizer (3 injekčné liekovky) prekročili regulačný limit pre SV40 promotor-enhancer-ori 2-násobne. Prítomnosť prvku SV40 promotor-enhancer v injekčných liekovkách Pfizer vyvoláva významné obavy o bezpečnosť. Táto štúdia zdôrazňuje dôležitosť metodických úvah pri kvantifikácii reziduálnej plazmidovej DNA v produktoch modRNA, vzhľadom na zvýšenú účinnosť transfekcie LNP, pričom kumulatívne dávkovanie predstavuje významné a nekvantifikované riziká pre ľudské zdravie.
Táto štúdia zdôrazňuje dôležitosť metodických úvah pri kvantifikácii reziduálnej plazmidovej DNA v produktoch modRNA, vzhľadom na zvýšenú účinnosť transfekcie LNP, pričom kumulatívne dávkovanie predstavuje významné a nekvantifikované riziká pre ľudské zdravie.
P.S. O hlbšej analýze tejto publikácie budeme ešte písať.
Publikované: 07.09.2025